实验指南 | 蛋白样品制备1——细胞裂解完全指南

Western Blot（WB）实验中，细胞裂解是蛋白样品制备的第一步，也是影响实验成败的关键。有效的裂解能完整释放目标蛋白，并保持其活性与结构，为后续步骤奠定基础。

蛋白质提取的目的是破坏细胞膜与细胞器膜，将蛋白释放到溶液中，同时保持其完整性。基本原理是利用化学、物理或机械方法破碎细胞结构。

 

一、不同来源的蛋白质样品提取方法

二、细胞裂解五大常见误区

误区一：采用“一刀切”的裂解方案

错误做法：许多研究者习惯用同一套裂解流程处理所有样品（如组织、贴壁细胞、悬浮细胞），忽略其结构差异。

原因分析：动物组织柔软但需研磨；植物细胞有细胞壁需机械破碎；微生物（如细菌）细胞壁成分特殊。若方法不当，会导致裂解不完全或蛋白降解。

正确做法：根据样品特性选择破碎方法。例如，动物组织优先用匀浆器研磨，贴壁细胞可直接加裂解液吹打；植物组织则采用珠磨法或高压匀浆法等机械破碎方法。

误区二：选错裂解液

错误做法：随意选用高强度裂解液（如强RIPA），认为“越强越好”，或忽略下游实验（如Co-IP需避免SDS）。

原因分析：高强度裂解液可能破坏蛋白互作或导致过度变性；而弱裂解液对膜蛋白提取不足。

正确做法：根据目标蛋白的溶解性和实验目的选择裂解液。例如：

可溶性蛋白：用中/弱强度RIPA或NP-40裂解液。

膜蛋白或核蛋白：优选强RIPA裂解液。

Co-IP实验：避免离子型去垢剂，选择温和裂解液。

误区三：蛋白酶抑制剂使用不当

错误做法：抑制剂添加不及时（如裂解液配制后久置）、浓度不准确，或忽略磷酸酶抑制剂（用于磷酸化蛋白研究）。

原因分析：细胞裂解释放的内源性蛋白酶会快速降解目标蛋白；PMSF等抑制剂在水中半衰期短，需现用现加。

正确做法：

现用现配：抑制剂在裂解前1-2分钟加入，确保活性。建议直接使用商品化蛋白酶抑制剂Cocktail，覆盖谱广且稳定。

浓度精准：参考蛋白酶抑制剂的工作浓度表，例如PMSF常用0.1-1.0 mmol/L。

误区四：忽略操作温度与时间控制

错误做法：裂解过程在室温下进行，或裂解时间过长（如超过30分钟），认为“时间越久越彻底”。

  

原因分析：高温会加速蛋白酶活性和蛋白变性；过度裂解可能释放基因组DNA，导致样品粘稠。

  

正确做法：

全程低温：操作在冰上进行，裂解液预冷。

时间优化：多数细胞裂解仅需1-2秒，组织需研磨至匀浆；离心步骤在4℃下进行。

注意事项：若裂解产物出现透明胶状物（基因组DNA），可短暂超声处理或离心取上清。

  

误区五：样品储存与处理不规范

错误做法：裂解后样品反复冻融，或未分装储存，直接用于长期实验。

原因分析：冻融循环会破坏蛋白结构，引起聚集或降解。

正确做法：

分装保存：裂解产物分装后于-80℃储存，避免多次冻融。

现用现制备：组织取材后分装，裂解后尽快用于下游实验。

 

三、万生昊天RIPA裂解液选择指南